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(1)可能為轉(zhuǎn)染效率低a.優(yōu)化轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)條件,用較易轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒做陽(yáng)性對(duì)照(如轉(zhuǎn)染過表達(dá)熒光蛋白質(zhì)粒);b.確保轉(zhuǎn)染DNA的質(zhì)量,可通過酶切或瓊脂糖凝膠電泳的方法對(duì)DNA質(zhì)量進(jìn)行鑒定;c.選擇活性較高,處于指數(shù)分裂期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。(2)可能為啟動(dòng)子活性低或誘導(dǎo)失敗a.轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)使用特異性誘導(dǎo)啟動(dòng)子的條件;b.優(yōu)化細(xì)胞的培養(yǎng)條件,提高螢光素酶的表達(dá)量;c.更換強(qiáng)啟動(dòng)子(如SV40、CMV)。注:海腎螢光素酶基因作為內(nèi)對(duì)照,其表達(dá)應(yīng)不受時(shí)期、部位、環(huán)境影響,因此常用組成型表達(dá)的TK啟動(dòng)子。(3)樣品裂解效率低a.細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不宜過長(zhǎng),12-36h內(nèi)最好,長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后,細(xì)胞可能會(huì)難裂解。b.加入的裂解液需足量,保證細(xì)胞能夠充分裂解。(4)檢測(cè)過程操作不規(guī)范a.選擇合適的檢測(cè)儀器,能夠檢測(cè)化學(xué)發(fā)光或者生物發(fā)光的儀器都適用于該實(shí)驗(yàn);b.需加入足量底物,保證底物的飽和,否則會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)很大偏差;c.室溫反應(yīng)。反應(yīng)時(shí)各個(gè)組分(細(xì)胞裂解產(chǎn)物,底物工作液等)都需要調(diào)整到室溫;d.螢光素酶的半衰期一般約30min,加完底物后可立即檢測(cè),盡量在30min內(nèi)完成。(5)底物氧化失效a.底物避光密封保存,螢火蟲螢光素酶底物-20℃保存;海腎螢光素酶底物推薦-80℃保存;b.反應(yīng)工作液建議現(xiàn)用現(xiàn)配。◆進(jìn)行檢測(cè)的過程中,螢光信號(hào)值太高該如何進(jìn)行調(diào)整?(1) 減少質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量。(2)細(xì)胞樣品裂解后,離心取上清后檢測(cè)或?qū)α呀猱a(chǎn)物進(jìn)行稀釋后檢測(cè)。注:不建議通過減少底物量來降低熒光值,需要保證底物的飽和來反映螢光素酶真實(shí)的表達(dá)水平,否則會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)大的偏差。
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